Enzim Glukanase

Glukanase Pada Tanaman

Creating Your Own Business. Click Here

Enzim ini secara luas ditemukan pada sebagian besar bakteri, jamur, dan tanaman tingkat tinggi. Terdapat dua jenis glukanase, yang pertama adalah ekso-β-1,3-glukanase menghidrolisis laminarin secara berurutan memotong residu glukosa dari ujung non-reducing suatu polimer atau oligomers. Sebagai konsekuensinya, hasil hidrolisis semata-mata berupa monomer glukosa. Tipe yang kedua adalah, endo- β-glucanase memotong pautan β-1,3 pada sisi yang acak sepanjang rantai polisakarida yang melepaskan oligosakarida yang lebih kecil (Cohen-Kupic et al 1999)

β-1,3-glukan adalah komponen struktur utama dinding sel dari banyak jamur pathogenic (Wessels and Sietsma, 1981, Adam, 2004). Sebagai contoh, Phytophthora infestans adalah pathogen oomycete yang menyebabkan late blight pada kentang dan tomat. Oomycetes mempunyai dinding sel yang terdiri dari 80-90% β-1,3-glukan. β-1,3-glukan (yang disebut callose pada tanaman) juga merupakan komponen dinding sel dari tipe sel tertentu selama fase perkembangan spesifik tanaman (Abeles and Forrence, 1969; Kauss, 1987, 1992; Kotake et al., 1997). Sebagai contoh, callose berperan sebagai rintangan permeable pada dinding sel pollen mother (Yim and Bradford)

Glukanase tanaman merupakan bagian yang penting dari mekanisme pertahanan tanaman dalam melawan pathogen jamur. Telah ada penelitian yang menyatakan bahwa mereka mempunyai peranan penting dalam diferensiasi sel (Donzelli et al.2001). Berdasarkan pada aktivitas hidrolitik dari β-1,3-glukanase dan hubungannya dengan infeksi pathogen, β-1,3-glukanase dinyatakan sebagai komponen penting dalam mekanisme pertahanan melawan pathogen (Kauffmann et al.,1987; Mauch and Staehelin 1989; Linthorst,1991; Cordero et al., 1994). Pada jamur, glukanase berperan dalam proses morphogenetic-morpholytic selama perkembangan dan diferensiasi. Glukanase terlibat dalam mobilisasi β-glucans saat sumber karbon dan energy telah habis, berperan sebagai enzim autolytic (De la Cruz et al.1995b). Buchner et al (2002) mengidentifikasi β-1,3-glukanase pada pea. Gen ini mempunyai pola ekspresi yang sangat spesifik yang berkaitan terutama pada perkembangan biji. β-1,3-glukanase telah ditemukan secara luas di dunia tumbuhan, sedangkan β-1,3-1,4-glukanase hanya diidentifikasi pada monokotil (Buchner et al.2002)

β-1,3-glukanase juga terlibat dalam interaksi pathogen jamur-tanaman yang mendegradasi callose ( β-D-1,3-glucan), komponen dari papilla, pada inang jaringan vascular saat diserang oleh pathogen jamur. Substrat khusus dari enzim ini adalah 1,3-glukan ditemukan sebagai callose dan laminarin di dinding sel jamur. Mereka diinduksi dalam responnya terhadap serangan pathogen atau cekaman lingkungan. Bersama dengan kitinase mereka mempunyai pertahanan-yang berhubungan secara fungsi biologis melalui penghambatan pertumbuhan jamur patogenik. (Jack et al.1995). Lebih jauh, Aziz et al (2003) menyatakan fakta bahwa β-1,3-glukan dapat digunakan untuk meningkatkan respon pertahanan tanaman. Sebagai contoh, laminarin (β-1,3-glukan berasal dari alga coklat Laminaria digitata) telah menunjukkan menjadi elisitor yang efisien dari mekanisme pertahanan tanaman grapevine dan dapat secara efektif menurunkan pertumbuhan B.cinerea dan P.viticola pada infeksi tanaman. Sebagai tambahan,enzim ini juga mempunyai peranan nutrisi yang penting dalam saprophytes dan mycoparasites. Peranan lain dari enzim ini adalah pelepasan elisitor dari dinding sel pathogen utuk induksi respon pertahanan (Keen and Yoshikawa,1983). Gen β-1,3-glukanase juga menjadi bagian dari jaringan khusus dan pengaturan perkembangan ekspresi induksi non-pathogen (Hird et al. 1993). Dalam pertumbuhan jaringan tanaman, enzim ini, berperan dalam pemutusan dinding callose tetrad dan pelepasan mikrospore muda ke rongga-rongga anther (Kotake et al.1997). Dan juga karena substrat untuk β-1,3-glukanase terdapat pada tanaman, enzim ini mungkin terlibat dalam berbagai proses fisiologi dan perkembangan tanaman, seperti pemanjangan sel, pembelahan sel, pemasakan buah (degradasi dinding sel yang mendorong kearah pelunakan buah, fertilisasi, dormansi tunas (pemindahan callose floem), mikrosporogenesis (pengubahan tetrad polen ke bentuk mikrospora bebas), embryogenesis somatic, perkecambahan benih dan pembentukan bunga. (Yanlin, 2005)

Keragaman fungsi enzim ini menyediakan berbagai macam keuntungan pada pertahanan tanaman tingkat tinggi melawan serangan mikroorganisme. Keanekaragaman, spesifitas organ dan perkembangan dan pola ekspresi yang berbeda menunjukkan bahwa β-1,3-glukanase memiliki fungsi biologis dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman sebaik peranannya dalam mekanisme pertahanan pada tanaman (Jin et al.1999)

Struktur Glukanase

Penelitian yang dilakukan pada tanaman barley, telah ditentukan bentuk tiga dimensi struktur β-1,3-glukanase, yang ditentukan melalui x-ray crystallography. Enzim memiliki struktur alpha/ β-barrel. Dasar alur sepanjang lengan penuh diatas permukaan molekul, tegak lurus pada sumbu barrel, dan diusulkan menjadi sisi terikat substrat polisakarida. Terdapat dasar potongan parallel ke sumbu utama molekul. Panjang potongan cukup untuk menampung 8 residu rantai β-1,3-glukan yang diperpanjang. Dua residu asam glutamik katalitik (E231 dan E288) terletak kira-kira sepertiga sepanjang potongan. Hal itu diasumsikan bahwa oksigen glikosidic terletak antara dua residu. Protonasi oksigen glikosidic oleh residu katalitik diikuti oleh stabilisasi ion aksikarbonium intermediate oleh nukleopil katalitik. E231 berfungsi sebagai nukleopil katalitik dan E288 berfungsi sebagai proton donor. Berdekatan dengan residu E288 adalah residu K282 dan E279. Residu ini tampaknya penting dalam mempengaruhi letak protonasi dari E288 asam katalitik. (Varghese et al., 1994)

Isolasi dan Purifikasi sebagian Enzim Ekstraselular (1,3)-β-D Glucanase dari Trichoderma reesei (3929) (Saravanan,et al., 2007)
Pendahuluan

Latar belakang

Genus Trichoderma banyak ditemukan sebagai mikroorganisme tanah. Mereka dikenal untuk kemampuan antagonisnya terhadap jamur lain dan kemampuannya untuk mendegradasi selulose. Filament jamur T.reesei adalah salah satu organisme sellulolitik paling berpotensi dan juga menghasilkan system xylanolitik, yang mengandung aktivitas ganda enzim untuk melengkapi degradasi xylan.

β-glucanase dari spesies Trichoderma adalah enzim yang penting yang digunakan dalam manipulasi genetic (pemisahan DNA, pembentukan protoplas) dan dalam pelepasan protein dan pigmen dari sel. Glukanase adalah enzim hidrolitik yang mampu menyebabkan lisis pada dinding sel. Produksi ekstrselular β-1,3-glukanase dilaporkan sebagai aktivitas enzimatik yang penting dalam biokontrol mikroorganisme

Tujuan

Percobaan bertujuan untuk mendeskripsikan isolasi dan purifikasi sebagian dari ekstraselular β-1,3-D-glukanase dari T.reesei (3929)

Bahan dan Metode

Sumber strain jamur: kultur strain induk T. reesei (3929) diperoleh dari M.T.C.C, Institute of Microbial Technology, Chandigarh, India

Pemeliharaan strain jamur: stok kultur dari jamur ini dipelihara pada media PDA pada 280C dan disubkultur secara periodic

Persiapan inokulum : miselium dari stok kultur diinokulasi pada media PDA dalam petridish dan diinkubasi selama 5 hari pada 280C untuk mendapatkan inokulum

Optimisasi media : optimisasi media kultur merupakan hal yang penting untuk pengembangan pertumbuhan dan produksi enzim glukolitik ekstraselular. Dalam percobaan meliputi penggunaan ekstrak ragi sebagai sumber karbon untuk meningkatkan kepadatan biomassa dan hasil

Pemeliharaan shake flask culture: duplikasi dilakukan pada media PDA yang diperkaya dengan ekstrak ragi. Kultur diinkubasi pada tabung 250 ml pada 280C selama 48 jam.
Koleksi supernatant: sentrifuge pada suhu 40C, 5000 rpm selama 20 menit untuk memindahkan padatan. Supernatant adalah subjek untuk presipitasi ammonium sulfat.
Presipitasi ammonium sulfat: dilakukan pada suhu 40C. Enzim mentah dipresipitasi dari 100 mL filterate, yang diperoleh dari media induksi dengan ammonium sulfat (60-70% saturasi) dan dilarutkan dalam 10 mL dari 0,01 M buffer sodium phosphate (pH 7,2)

Purifikasi sebagian enzim: aseton dingin (disimpan pada -200C) secara perlahan ditambahkan pada 100 mL filtrate kultur (saturasi 70%) pada magnetic stirrer. Setelah didiamkan semalam pada 40C dan sentrifugasi (10.000 x g, 30 menit pada 40C), endapan dimasukkan lagi dalam 15 mL dari 0,1 M buffer sodium fosfat (pH 7,2) dan didialisis lagi buffer yang sama. Luas flat dari membrane dialysis yang digunakan adalah 29,31 mm, diameter 17,5 mm dan kapasitas kira-kira 2,41 mL/cm. Solusi enzim ini digunakan untuk penelitian karakterisasi

Pengujian aktivitas enzim: aktivitas glukanase dihitung melalui pengukuran sejumlah glukosa bebas dari substrat laminarin menggunakan metode spesifik Glucose Oksidase Peroksidase untuk glucose. Campuran reaksi mengandung 0,5 mL sample dialysis, untuk itu 0,5 mL dari 0,05 M substrat laminarin (pH 4,8) ditambahkan dan diinkubasi pada 350C selama 40 menit. Reaksi diakhiri oleh penambahan 2 mL 6 N HCl. Pembentukan warna merah mengindikasikan adanya glukanase pada sampel dialysis.

Perkiraan protein: kandungan total protein diperkirakan menurut metode Lowry et al (1951)

Perkiraan penurunan gula: penurunan zat (gula) diperoleh mengacu pada reaksi enzimatik yang ditentukan oleh metode DNS (Miller et al, 1959)

Penentuan berat molekul protein: berat molekul enzim β-glukanase yang dihasilkan oleh T.reesei(3929) dikonfirmasi oleh SDS-PAGE.

Hasil dan Diskusi

Keberhasilan pertumbuhan T.reesei dapat dilihat pada potato dextrose sebagai warna hijau setelah 5 hari inkubasi pada kultur pada kisaran suhu 25-280C. Pemilihan sumber karbon dan energy menjadi hal yang penting dalam proses produksi ekstraselular hidrolisa oleh filament jamur. Untuk mendapatkan produksi enzim maksimum, ekstrak ragi ditambahkan pada media shake flask culture pada konsentrasi 4%

Pemisahan Glukanase: glukanase dipisahkan dari media kultur melalui sentrifusi kultur pada 5000 rpm selama 20 menit dibawah kondisi dingin dikumpulkan dalam supernatant

Presipitasi ammonium sulfat dan dialysis: protein dipresipitasi dari supernatant kultur dengan memperlakukannya dengan 60-70% ammonium sulfat yang disaturasi dan protein yang dipresipitasi didialisis dan digunakan untuk study selanjutnya

Uji aktivitas enzim: aktivitas enzim diperkirakan melalui proses dari metode glucose oksidase peroksidase. Pembentukan warna merah diamati.

Dalam percobaan yang dilakukan aktivitas enzim diperkirakan dengan menggunakan substrat laminarin, linier β-(1,3) glukan. Glukanase menghidrolisis molekul glukan, mendorong produksi residu glucose. Glucose oksidase mengkatalisis oksidasi glukosa menjadi asam glukonik dengan pembentukan hydrogen peroksidase. Pembebasan oksigen dari hydrogen peroksidase oleh aksi peroksidase, bereaksi dengan O-dianisidine dan mengoksidasinya menjadi produk kromopor merah. Pembentukan warna merah mengindikasikan adanya glukanase dalam sampel dialysis.

Perkiraan protein: jumlah total protein yang ada dalam 100 mL sampel yang didialisis ditemukan menjadi 140 mg

Perkiraan reducing gula: 100 mL enzim diketahui melepaskan 126 mg reducing gula (glucose)
Penentuan berat molekul protein: dari study yang dilakukan, BSA yang digunakan sebagai marker protein standard, karena memiliki berat molekul yang kurang lebih sama dengan glukanase. Pengamatan ini sejalan dengan laporan oleh Emert et al (1974) yang mencatat berat glukanase adalah 52-62 kDa. Brown (1972) menemukan bahwa β-glukanase berperan sebagai protein acidic, yang berpikir bahwa β-glukanase sebagai tipe enzim ekstra selular yang mungkin dianggap sebagai glikoprotein.

Pada umumnya, property enzim seperti berat molekul dan co-efficient sedimentasi adalah dalam kisaran yang dilaporkan penulis lain (Bull, 1967; Kitamura et al.,1974). Tampak jelas bahwa enzim yang dipurifikasi adalah tidak spesifik, yang mungkin menghidrolisis keduanya (1,3)-β-dan (1,6)-β-linkages. Hal itu penting bahwa enzim menunjukkan afinitas terhadap laminarin daripada pada (1,3)-β-D-glukan. Hasil yang ada menunjukkan bahwa mode aksi enzim cocok untuk mekanisme exospliting saat itu terjadi di laminarin. Penelitian ini dapat diperluas untuk pembelajaran dan kinetic yang dapat mengungkapkan stabilitas enzim untuk variasi yang luas pada kondisi lingkungan seperti pH dan suhu, yang dapat dieksploitasi untuk rancang bangun enzim.

Daftar Pustaka

Aziz, A., Poinssot, B., Daire, X., Adrian, M., Bezier, A., Lambert, B., Joubert, J-M.,
Pugin, A. (2003) Laminarin elicits defense responses in grapevine and induces protection against Botrytis cinerea and Plasmopara viticola. Mol. Plant-Microbe Interact. 16, 1118–1128.

Buchner P, Rochat C, Wuilleme S, Boutin JP. 2002. Characterization of a tissue-specific and developmentally regulated β-1,3-glucanase gene in pea. Plant Molecular Biology 49: 171-186

Bull, A.T. 1967. Purification of an exo β-D-glucanase from cell free-extracts of Candida utilis. Int. Biodeteriop. Bull.,3:3-12

Cohen-Kupiec R, Broglie K, Friesem D, Broglie R, Chet I. (1999). Molecular characterization of a novel β-1,3-exoglucanase related to mycoparasitism of Trichoderma harzianum. Gene 226, 147-154

De la Cruz J, Pintor-Toro JA, Benitzer T, Llobel A. 1995a. Purification and characterization of an endo-β-1,6-glucanase from Trichoderma harzianum that is related to its mycoparasitism. Journal of Biotechnology 177:64-71

Donzelli B, Lorito M, Scala F, Harman G. 2001. Cloning, sequence and structure of a gene encoding an antifungal glucan 1,3-beta-glucosidase from Trichoderma atroviride (T.harzianum). Gene 277: 199-208

Hird DL, Worall D, Hodge R, Smartt S, Paul W, Scott R. 1993. The anther-specific protein encoded by the Brassica napus and Arabidopsis thaliana genes display similarity to β-1,3-glucanase. Plant Journal 4:1023-1033

Jach G, Gornhardt B, Mundy J, Logemann J, Pinsdorf E, Leah R, Schell J, Maas C. 1995. Enhanced quantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco. The Plants Journal 8: 97-109

Jin W, Horner H, Palmer R, Shoemaker R. 1999. Analysis and mapping of gene families encoding β-1,3-glucanase of soybean. Genetic153:445-452

Keen NT, Yoshikawa M. 1983. β-1,3-endoglucanase from soybean releases elicitor-active carbohydrates from fungal cell walls. Plant Physiology 71:460-465

Kitamura, K., T. Kaneka and Y.Yamamoto, 1974. The linkage between chitin and beta-(1,3)-glucan Architecture of yeast cell wall. J. Gen. Apllied Microbiol., 20: 323-344

Kotake T, Nakagawa N, Takeda K, Sakurai M. 1997. Purification and characterization of a wall-bound exo-1,3- β-glucanase from barley seedlings. Plants Cell Physiol 38:194-200

Saravanan, R., V.Pavani Devi, A.Shanmugam and D. Satish Kumar. 2007. Isolation and partial purification of extracellular Enzyme (1,3) β-D glucanase from Trichoderma reesei (3929)

Yanlin Shi. 2005. Isolation, characterization, and expression analysis of β-1,3-glucanase genes from strawberry plants. Dissertation submitted to the Graduate Faculty of the Lousiania State University and Agricultural and Mechanical College